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      激活型NIR-II熒光探針用于β-淀粉樣蛋白的體內成像

      瀏覽次數:1924 發布日期:2023-5-11  來源:恒光智影

      本文要點:阿爾茨海默病(AD)是臨床最廣泛的神經退行性疾病,嚴重威脅人們的生命健康。β 淀粉樣蛋白 (Aβ) 作為AD的典型病理生理學標志物,來源于單體 Aβ 自發聚集成形成不溶性Aβ原纖維,積聚并沉積在大腦中,從而誘發神經系統性疾病。目前還沒有有效的策略來治療AD的發生發展。腦脊液的診斷過程具有侵入性(脊髓穿刺),因此不被廣泛接受。相比之下,開發用于檢測Aβ蛋白的成像探針為AD的早期表征和及時干預提供了有效策略,如正電子發射斷層掃描(PET)、單光子發射計算機斷層掃描(SPECT)和磁共振成像(MRI)等。然而這些探針具有靈敏度低、成本高、電離輻射和高背景等缺點,因此開發可激活熒光探針具有重要意義。



       


      目前,用于Aβ蛋白的成像熒光探針有硫黃素T(ThT)和硫黃素S(ThS),但他們的發射波長短(480 nm),血腦屏障(BBB)穿透能力差,限制了它們的體內應用。此外,雖然有一些可激活的熒光探針用于Aβ蛋白的體內成像,但這些探針的熒光發射通常位于NIR-I區(650–900 nm) ,穿透深度淺,信噪比(SNR)低,不適合腦組織成像。因此本文作者開發了NIR-II區(900–1700 nm)發射的可激活熒光探針用于Aβ蛋白的體內成像(圖1)。

       


      圖1. DMP2用于Aβ蛋白的體內成像

       

      首先,作者設計并篩選了一系列Aβ蛋白的特異性NIR-II熒光響應探針(D-π-A結構),探針由三部分組成:咔唑或二甲氨基苯為電子供體(D),噻吩橋或雙鍵為π橋,同時提高親脂性(容易透過BBB),以及苯并吲哚鎓作為電子受體(A),合成了熒光探針ECV、DMP1、DMP2和DMP3(圖2a)。隨后,作者評價了探針的光學性能。溶劑效應測試說明ECV發射位于NIR-I區,其他三種化合物均處于NIR-II區(圖2e-h)。Gaussian09W計算進一步說明更強的給電子作用能夠增強推拉效應,從而產生NIR-II區的紅移熒光(圖2i)。


      圖2. (a) 探針的分子結構 (e、f、g、h) ECV、DMP1、DMP2和DMP3探針在不同極性溶劑中的熒光光譜。(i) 探針在水中的HOMO-LUMO能極差。

       

      此外,作者還觀察到這四種探針對粘度有依賴性的熒光變化,所以推斷探針可能發生了扭曲的分子內電荷轉移過程(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT)。TICT效應已被用于檢測A β蛋白的熒光探針的構建,抑制分子內的TICT效應能夠提高熒光探針的穩定性和量子產率。緊接著,作者測試并篩選了探針對Aβ原纖維的響應情況。與Aβ原纖維孵育后,DMP1、DMP2和DMP3的NIR-II熒光分別選擇性的增強了27.0倍、41.8倍和43.1倍,而ECV幾乎無差異(圖3f-h)。熒光增強可能是由于Aβ原纖維介導了探針在光照射情況下從非發射扭曲的TICT狀態轉變為高熒光準平面局部激發(LE)狀態。相比于商業探針ThT僅5.1倍的熒光增強,DMP2和DMP3具有更理想的成像對比度;跓晒獾娘柡徒Y合法計算DMP2的結合親和力(Kd)為42.0 nM,與Aβ原纖維具有最佳的結合親和力(圖3i-k)。然后作者使用DMP2測試其與ThT結合的Aβ原纖維的競爭位移能力,置換率高達72%(圖3l)。


      圖3. (e) 探針與Aβ聚集體結合后的熒光增強倍數 (f、j、h) 探針在其他潛在干擾物存在時對Aβ聚集體的選擇性研究(1-10:潛在干擾物,離子、氨基酸和牛血清白蛋白等11:Aβ 單體) (i、j、k) PBS溶液中探針的結合親和力測定 (l) DMP2和ThT探針的競爭置換實驗。

       

      然后,作者使用分子對接軟件模擬了探針與Aβ原纖維之間的相互作用(圖4),進一步說明了DMP2探針具有高選擇性的熒光“off-on”響應和與Aβ蛋白的強結合親和力,在檢測Aβ蛋白方面具有很大前景。


      圖4. DMP2與Aβ原纖維的相互作用圖

       

      隨后,作者檢測了DMP2與Aβ蛋白結合后NIR-II熒光的穿透深度。NIR-II熒光在0.5 cm厚度下的信噪比仍然為20.4,在1.5 cm的厚度上,NIR-II熒光信號仍是可識別的(圖5a-b)。與此同時,作者通過構建體外血腦屏障模型(圖5c)測試了DMP2穿透血腦屏障的能力。DMP2的通透性隨孵育時間的增加而增加,120 min后達到23.8%,比ThT高9.9倍,與FDA批準的可穿透血腦屏障的藥物替莫唑胺(TMZ)相當,說明其其親脂性適合穿透血腦屏障(圖5d)。


      圖5. (a、b) DMP2探針在溶液和腦切片中的組織滲透能力研究 (c、d) 體外血腦屏障模型及Transwell室滲透性試驗

       

      在活體測試中作者選用探針DMP2與商業探針ThS分別對野生型小鼠和轉基因AD模型小鼠的腦組織切片進行成像對比,正如預期的,在DMP2或ThS染色后,在野生型小鼠腦切片中沒有觀察到明顯的熒光。相比之下,在用ThS和DMP2染色后,來自AD模型小鼠的腦切片在大腦皮層和海馬區域顯示出聚集性熒光,表明DMP2對Aβ蛋白的檢測具有高度特異性。此外,對腦切片中線性靶向區域熒光強度的定量研究進一步說明了DMP2和ThS均可染色Aβ蛋白,但前者的信號更強(圖5 e-f)。


      圖5 (e、f)野生型小鼠和轉基因AD模型小鼠的腦組織切片成像

       

      最后在體內成像時,作者選用8月齡的APP/PS1轉基因AD模型小鼠和野生型小鼠進行研究(圖6a)。野生型小鼠在注射DMP2后各個時間點的腦內熒光信號均較弱。而AD模型小鼠僅注射后10分鐘就觀察到了明顯的NIR-II熒光信號,且能在腦內長時間保留,可用于體內實時縱向成像(圖6b)。隨后作者處死小鼠提取腦組織,記錄NIR-II熒光成像,進一步證實NIR-II熒光來源于AD小鼠腦組織。同時,共聚焦成像顯示的皮層和海馬部位明顯的熒光信號說明DMP2可以高效高特異性的識別AD模型小鼠的Aβ蛋白,可用于Aβ蛋白的無創成像,深入了解疾病的發生發展(圖6f)。


      圖6 (a) DMP2探針的NIR-II熒光成像示意圖 (b)野生型小鼠和AD模型小鼠的活體腦成像 (f) Aβ單克隆抗體(MOAB)染色后的腦組織切片離體熒光圖像

       

      參考文獻

      Miao, J., Miao, M., Jiang, Y., Zhao, M., Li, Q., Zhang, Y., et al. (2023). An Activatable NIR-II Fluorescent Reporter for In Vivo Imaging of Amyloid-beta Plaques. Angew Chem Int Ed Engl, 62(7), e202216351.

       

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