“ 肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。”
肾脏需要满足多样化的生理功能，因而拥有了迷人的复杂结构。起初，对肾脏的研究仅限于宏观观察，其对肾脏疾病诊断的贡献无疑是有限的。宏观观察描述了临床表现，但潜在的发病机制却无法解释。肾脏生理学和病理生理学方面的成就很大程度上归功于显微镜领域的持续进步。1666 年，解剖学家 Malpighi 用光学显微镜检查了肾脏组织，该显微镜的放大倍率估计为 ×25-30，并首次将肾小球描述为“尿液与血液分离的腺体”。这一发现一直被忽视，直到 1842 年，William Bowman 才用更大放大倍率的光学显微镜解开了肾单位结构。Bowman 发现肾小球周围囊（ Bowman 囊）在解剖学上与肾小管的第一部分相连 。1862 年，Jacob Henle 描述了以他的名字命名的环状小管段，连接皮质小管和肾乳头。由于引入了光学显微镜，肾脏疾病的组织形态学分类成为可能。观察患病肾脏中发生的情况使人们能够了解具有相似临床表现的患者之间的病理变化有很大差异。然而，最初对肾组织病理变化的研究是在尸检样本上进行的，主要聚焦于对慢性疾病的描述，缺乏关于肾脏病理演变的信息，并且存在自溶现象的技术问题，限制了对肾脏疾病的进一步认识。1951 年，肾活检的引入使得不仅可以直接观察和研究慢性肾脏疾病，还可以直接观察和研究急性肾脏疾病。与此同时，显微镜逐渐变得更加复杂，灵敏度和分辨率逐渐提高到纳米级。在这篇综述中，概述了显微镜技术的进步对肾脏基础发现研究，尤其是新兴技术发展演变带来的可能性。
01研究结果
1、肾脏免疫病理学可视化
1.1 免疫标记和荧光显微镜
免疫荧光已被纳入评估冷冻肾活检标本的诊断程序中。主要用于肾小球肾炎、IgA 肾病，以及感染后肾小球肾炎和膜增生性肾小球肾炎。
1.2 共聚焦显微镜
共聚焦显微镜的引入，使荧光显微镜得到极大技术改进。共聚焦显微镜完成了第一次在实验模型中对肾脏进行体内研究，并通过微穿刺后观察荧光分子，允许在生理和病理条件下研究肾小管功能。
利用共聚焦显微镜沿 z 轴顺序成像光学切片，及特定分析软件对较厚组织标本进行 3D 渲染，可对 2D 分析进行纠正和补充。但共聚焦显微镜仍然无法分辨小于 200 nm 的细节。
图1. 共聚焦显微镜、电子显微镜及多光子显微镜的成像及原理
2、肾小球滤过屏障：电子显微镜
1931 年，电子显微镜问世，因其使用加速电子束而不是光束作为激发源，进而达到了更高的分辨率—— 0.2 nm。由于分辨率的提高，很快就发现肾小球不仅仅是一个机械过滤器，而是一个三层组成的极其复杂的器官：内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞。电子显微镜是一种强大的工具，不仅可以用于理解正常肾小球超微结构，还可以用于理解肾脏生理学和病理生理学。对人体样本或实验模型进行的大量研究表明，不同的疾病过程与一组独特的超微结构改变模式相关，这意味着对肾脏疾病分类系统的进一步更新。
电子显微镜技术仍在不断发展，块面扫描电镜允许对肾小球滤过屏障从 2D 视图到 3D 视图，其分辨率足以跟踪健康小鼠、患病小鼠和肾脏发育过程中最薄细胞过程的纳米结构。且电子显微镜可与X 射线显微镜耦合以在超微结构水平上对细胞或细胞部分进行元素分析。
3、使用多光子显微镜观察肾脏生理
多光子显微镜为肾脏研究提供了进一步的进展，即同时实时研究肾功能和结构关系的可能性 。与传统的光学显微镜不同，增加了深层组织渗透并最大限度地减少了光毒性。这使研究人员前所未有的直接在活体动物中可视化动态细胞过程。多光子显微镜允许量化基本肾功能和病理改变，例如肾小球通透性、血管血流量、单肾单位肾小球滤过率和肾小管流量 。此外，多光子显微镜允许研究响应损伤的细胞内过程，进一步的技术改进允许活体成像持续数天至数周。多光子显微镜也可以使用无标记成像技术，利用天然自发荧光来研究肾细胞的代谢状态。
活体显微镜的最新创新是微型多光子内窥镜，这种微创多光子显微镜可能为实时体内诊断铺平道路，无需去除组织，而且时间很短。
4、3D 肾脏：组织清除技术和扩展显微镜检查
肾组织不透明，使肾脏成为最具光学挑战性的器官之一。组织清除技术的目的即是将不透明的组织转换为透明的组织，保留蛋白质并最终保留荧光标记，以对厚组织切片进行成像。光学清除与最先进的显微镜相结合提供了形态测量分析的可能性，例如在厚组织甚至完整肾脏中量化肾小球体积和数量。其他应用包括分析不同的小管段、它们的功能和量化足细胞损失 。
为了对大量组织进行成像，同时解析精细的结构细节，最近还引入了另一种新的技术方法，即扩展显微镜 。这种技术是将整个器官物理扩展 4 到 5 倍，同时保留整体架构和 3D 蛋白质组内容。使用在样品中直接合成的膨胀聚合物，与光的衍射极限相近的分子在空间中各向同性地分离到更远的距离，因此即使通过传统的荧光显微镜也可以进行光学解析。体积成像的进步允许对整个器官进行高分辨率 3D 分析，深度成像的主要限制现在表现为抗体穿透组织的能力。
5、代谢特征研究：频域荧光寿命成像显微镜
肾脏是线粒体含量很高的代谢器官。NADH 的还原形式和其他代谢物具有天然荧光，这种自发荧光可用作氧化还原状态的指标。然而，这些内源性荧光团的发射光谱是重叠的，不可能单独识别它们。但是荧光寿命（即荧光的时间衰减）有显著差异。因此，荧光寿命成像显微镜允许研究代谢特征。频域荧光寿命成像显微镜有望为健康和疾病中的体内肾脏代谢提供进一步的见解。
6、突破极限：肾脏超分辨率成像
标准光学显微镜面临 200 nm 的光学分辨率限制。作为纳米显微镜时代的起点，超分辨率成像的新技术允许荧光显微镜成像超出其衍射极限。这些方法结合了纳米级分辨率和多色荧光标记的优点。为表彰这些创新的潜在影响，2014 年诺贝尔化学奖授予 Eric Betzig、Stefan Hell 和 William Moerner，因为他们开发了超分辨荧光显微镜。不同的超分辨率成像策略可用于解决不同的生物学问题。这些方法可以分为两大类，具体取决于超分辨率是在单分子水平还是在整体水平上。
图2. STED显微镜原理及与共聚焦显微镜的成像对比
6.1 集成技术
基于集成的技术通过在时间和空间上调制激发光束来打破衍射极限。其中，超分辨率受激发射耗�。⊿TED）成像使用两种激光，一种是激发激光器，另一种是叠加的红移耗尽激光器（STED 激光器），呈甜甜圈形状，以抑制荧光团的荧光发射位于激发的中心。这种抑制是通过受激发射实现的，并且只允许收集来自尺寸低于衍射极限的焦点的信号。
STED 显微镜需要用于样品制备、特殊荧光团和技术培训的特定实验方法。出于这个原因，在过去几年里，另一种超分辨率技术——结构照明显微镜 (SIM) 得到了更多的关注，它可以将衍射极限横向和轴向扩展两倍。SIM 使用具有细条纹照明图案的宽视野显微镜设置，允许在较低空间频率下捕获高频信息（对应于样品中的精细细节）。通过获取具有不同相位和方向的照明模式的多幅图像，可以重建高分辨率图像。SIM 与标准荧光团兼容，不需要特定的样品制备并允许 3D 可视化。各种微小病变的成功识别，既表现出纳米级病理的疾病改变的能力证实了 SIM 是一种很有前途的常规诊断工具。
6.2 基于单分子定位的成像方法
此类技术依赖于循环打开和关闭太近而无法解析的单个荧光分子的可能性。在这些方法中，衍射受限区域内的分子可以在不同的时间点被激活，以便它们可以单独成像，然后通过计算找到它们的中心以纳米精度定位。在这些方法中，随机光学重建显微镜 (STORM) 于 2013 年首次引入肾脏研究，一项研究以纳米精度揭示了 GBM 的复杂分子组织，包括分子的方向 。在罕见的先天性肾病综合征的小鼠模型中，STORM 揭示了静脉注射后 GBM 中层粘连蛋白 521 的整合和正确定向，为患者的高级治疗选择开辟了道路。另一项研究以分子尺度分辨率描述了足细胞中肌动蛋白细胞骨架的组织。
7、原子水平可视化基本生物分子 3D 结构：低温电子显微镜
研究基本生物分子结构的可能性仅限于电子显微镜，因其具有极高的几nm分辨率。但强电子束造成的样品损坏、低图像对比度和与电子相互作用后的分子运动或难以在电子显微镜室内施加的真空中保存生物样品中的水分，使得无法解析低于此尺寸的分子。冷却样品可以减少水分蒸发和电子诱导的损伤。根据这个想法，低温电子显微镜在 1950 年代被引入。
在肾脏研究中，基本蛋白质的结构是在原子水平上确定的，低温电子显微镜正适用于此种场景。
8、了解肾脏疾病的分子基�。赫仙鲈嘞晕⒕�
基质辅助激光解吸/电离成像质谱 (MALDI-IMS) 允许特异性且无标记地同时绘制组织中分子全谱图，直接在组织切片上以高分辨率同时测量数百种不同的分子。在 MALDI-IMS 实验中，冷冻或石蜡包埋的薄组织切片涂有吸收激光能量并促进组织分析物电离的基质。质谱仪中的分析为每个 x/y 坐标生成一个光谱。在 MALDI 测量之后，可以使用传统的组织化学和免疫组织化学程序对同一组织切片进行染色，以将分子模式与组织学细节相结合。在肾脏研究中，MALDI-IMS 用于研究正常和患病组织中的药物、代谢物、脂质、肽和蛋白质 。
MALDI-IMS 最常见的应用之一是鉴定分子标记以对肾细胞癌进行分类并在分子和组织学水平上确定癌组织和正常组织之间的真实界限。MALDI-IMS 也已成功用于研究肾脏药物毒性，以提供由候选药物介导的毒性肾脏损伤机制的早期检测。此外，MALDI-IMS 用于研究脂质及其在肾脏病理学中的作用，如糖尿病肾病、急性肾损伤和多囊肾病，还用于揭示内源性代谢特征，以便更深入地了解疾病相关机制�；箍捎糜谌范ㄉ锉曛疚锏姆肿油计�，这些生物标志物可能是新的潜在诊断和预后生物标志物。
表1. 各类显微成像技术对肾脏研究的适用方向
02 研究总结
肾脏生理和病理生理机制方面的重要成就很大程度上归功于显微镜技术的进步。人们对肾脏结构的了解大部分是基于解剖显微镜师使用光学显微镜和后来通过电子显微镜提供的超微结构分析的基本描述。这两种技术被用于肾脏疾病的第一个分类系统并不断更新。当下，一系列新兴的成像技术增加了对时间和空间维度的进一步分析。共聚焦显微镜使研究者能够沿 z 轴顺序可视化光学切片，并且特定分析软件使较厚组织标本的三维渲染成为可能。多光子显微镜使研究者能够同时实时进行肾功能研究和肾结构研究。荧光寿命成像显微镜可以研究代谢物的空间分布。超分辨率显微镜将灵敏度和分辨率提高到纳米级。借助低温电子显微镜，研究人员可以直接在组织中以原子水平观察单个生物分子，并了解它们在亚细胞水平上的相互作用。最后，基质辅助激光解吸/电离成像质谱允许以高分辨率同时测量组织切片上的数百种不同分子。
成像技术的不断改进逐步解决了肾脏研究中的许多关键技术障碍，并允许动态描绘正常和患病肾脏的结构和功能。新显微镜技术的出现促成了基础科学发现，并随之改变了人们对肾脏生理学和病理生理学的认识，如今可以进行 3D 可视化甚至进行视频拍摄，增加了第四个观察维度——时间。随着超分辨率显微镜的最新技术创新和分子成像技术的进步，研究人员现在可以直接在组织中可视化单个生物分子，并确定它们如何在细胞和亚细胞水平上相互作用。将这些工具应用于病理肾脏标本，将侧重于临床活检中的分子和亚细胞细节，未来会对疾病的重新分类带来可能。
参考文献：
1. Maria Lucia Angelotti, Giulia Antonelli, Carolina Conte, Paola Romagnani, Imaging the kidney: from light to super-resolution microscopy, Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 36, Issue 1, January 2021, Pages 19–28, https://doi.org/10.1093/ndt/gfz136
