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      貼壁細胞培養五大難題原因及解決發法

      瀏覽次數:463 發布日期:2024-4-24  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

      貼壁細胞(adherent cells),這類細胞的生長必須有可以貼附的支持物表面,如:培養(瓶)器皿壁上,細胞依靠自身分泌的或培養基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長,繁殖。細胞一經貼壁就迅速鋪展,然后開始進行有絲分裂,并很快進入對數生長期。
       

      當細胞在該表面生長后,一般形成兩種形態,即成纖維樣細胞性或上皮樣細胞。貼壁細胞生長過程分為五個時期,分別是游離期、貼壁期、潛伏期、對數期、平臺期和衰退期。

       

      貼壁細胞因其培養過程較為繁瑣,所以培養時更容易出現問題。今天,就圍繞貼壁細胞培養中常見的5大常見問題,與大家一起探討詳細原因和解決方法。
       

      一,傳代后部分細胞漂浮

      原因及解決方法如下

      1,傳代前細胞密度太大::一般細胞融合度達到80%時就可以進行傳代操作了,傳代密度需適中,傳代密度過高也會導致傳代后漂;

      2,細胞狀態不好:可通過提高血清比例、穩定培養環境等方法進行改善;

      3,吹打次數過多造成機械損傷:輕柔吹打,細胞呈單顆粒時可停止吹打,吹打過程避免氣泡產生;

      4,培養基更換后不適應:更換回原來的培養基;或者與原培養基比例混合后使用,使細胞有個適應期;

      5,培養液配制、儲存不當,如pH值過堿,Gln量太少等原因;

      6,接種細胞數目太少,無法分泌足夠的細胞外基質;

      7,復蘇時處理速度太慢,復蘇過程不當。


      二,傳代后細胞變形

      原因及解決方法如下

      1,變形,但細胞還在生長:可能是血清批次不一樣導致,血清成分復雜,不同批次和品牌間均存在成分差異,影響細胞狀態。建議使用同一批次血清,更換血清時需與原血清比例混合后使用,使細胞有過渡期;

      2,變形,但細胞不長,且碎片增多:可能傳代操作過程損傷,常見于消化不當,或者潛在支原體等污染導致細胞病態;消化時間根據每個細胞的狀態來調整,消化過度或者消化不充分均會對細胞造成影響;培養過程應嚴格無菌操作,實驗環境盡量潔凈,確保細胞無外源污染。


      三,細胞生長周期變慢,邊養邊漂

      原因及解決方法如下

      1,細胞傳代時密度太稀或太密:建議細胞融合度達80%左右進行傳代,傳代密度適中,密度過低會延長生長周期,密度過高會有接觸抑制;

      2,傳代操作不當:根據細胞特性決定細胞消化時間,一般在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化,難消化的細胞可分次消化,每次時間不超過5min;頻繁換液或者清洗細胞也會導致細胞狀態變差,常規換液時間間隔為2~3天。


      四,傳代后細胞成團

      解決方法如下

      1,低密度接種,延長換液時間,防止細胞脫落;

      2,使用多聚賴氨酸包被培養器皿,以增加細胞貼壁牢固度,降低細胞聚集成團的幾率;

      3,重新鋪板,并更換新配制的培養基,加大血清比例(增加比例不超過5%);

      4,接種時,減少培養基量(如T25加3mL)以加快細胞貼壁速度,等待細胞貼壁后(約8-12小時),再補加培養基到正常用量。


      五,細胞出現空泡

      原因及解決方法如下

      1,正常的細胞活動:有的細胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動,無需特殊處理(如Caco-2細胞);

      2.血清不適應、培養基成分改變、換液不及時等造成細胞營養不良:可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決;

      3,機械損傷、PH偏高或偏低等造成細胞受損:注意培養條件及操作手法。


      六,如何促進細胞貼壁

      1,適度消化細胞:HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長,一般處理5-6min,C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落,2min足矣,P19Cl6和293細胞貼壁不緊,可在PBS漂洗后,直接換新鮮培養基打散。

      2,最好用塑料瓶培養,如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養瓶,或者用鹽酸對培養瓶進行蝕刻,或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA,也可以幫助細胞貼附新的培養瓶,細胞不易貼壁,建議加多聚賴氨酸處理。

      3,正確配制消化液或培養液。

      4,使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

      5,復蘇新的細胞,第一周用20%血清幫助細胞復原。

      6,傳代接種一定要鋪的均勻,避免細胞抱團生長。

      7,細胞傳代24小時之內,最好不要晃動,以免影響貼壁。

      8,體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上,因此培養在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養,可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養層,另外降低pH、Ca2+含量和溫度,均有利于上皮細胞生長。
       

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