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      懸浮細胞的電融合實驗步驟

      瀏覽次數:600 發布日期:2024-4-29  來源:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
      懸浮生長細胞的電融合
      融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似,只是在進行高強度的電場脈沖前后,必須用低幅、高頻電場使細胞排成一條鏈。
      1 用融合介質(FM)洗懸浮細胞兩次,然后懸于FM中。洗滌細胞時,在臺式離心機上1000rpm下離心3分鐘,得到細胞沉淀,棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質中。
      2 將懸浮細胞轉移到相應的融合室內。假如要使兩種不同的細胞彼此融合,轉移前要充分混合。
      3 啟動介電電泳場,其振幅通常小于200V/cm,頻率在2MHz以內,用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈,調節振幅和頻率以達到最佳效果。
      4 讓介電電泳場開約1分鐘后關掉,立即應用融合脈沖,其振幅數量級為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場,常規讓其開啟約2分鐘。
      5 關掉介電電泳場,讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。
      6 去掉FM,用普通培養基再次洗滌細胞。
      7 將細胞轉移到培養皿,加入普通培養基,在培養箱一般條件下培養。

      [注意事項]
      1 最優組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優化電壓和脈沖寬度電穿孔結果仍不令人滿意,就應嘗試改變穿孔介質。
      2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態有關,為達到最高效率,必須收集對數生長中期的細胞。
      1.純化siRNA
      在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結合,洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。注意:化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。
      2.避免RNA酶污染
      微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在,如皮膚,頭發,所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等,此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
      3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性
      通常,健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。
      4.避免使用抗生素
      抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下,可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗,以得到最佳轉染效果。
      5.選擇合適的轉染試劑
      針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同,選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。
       6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件
      對大多數細胞,看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞(同樣適合實驗靶siRNA),轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。
      7.通過標記siRNA來優化實驗
      熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。
      來源:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
      聯系電話:0512-62956104
      E-mail:jie_wu@bioalpha.cn

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